久久久久亚洲精品无码蜜桃,亚洲AV成人无码久久精品,无码国产精品一区二区免费16,熟妇高潮精品一区二区三区

您好!歡迎訪問上海根生生物科技有限公司網(wǎng)站!
全國服務(wù)咨詢熱線:

15216781845

當(dāng)前位置:首頁 > 技術(shù)文章 > 伯樂Bio-Rad垂直電泳槽的使用

伯樂Bio-Rad垂直電泳槽的使用

更新時(shí)間:2015-04-09      點(diǎn)擊次數(shù):13806

實(shí)驗(yàn)材料

?BSA(1 mg/ml),0.05 g的BSA(Sigma-Aldrich Ltd.)溶于50ml ddH2O中,每Eppendorf管約加入1ml溶液,并在-20℃下冷凍。

?預(yù)染色marker (Bio-Rad)

?ProMarker(Wealtec)

?兩套玻璃板與校正卡,厚玻璃板與U形玻璃板,0.75 mm厚膠條和一個(gè)0.75 mm 10齒梳(Wealtec)

?濃度為12%的SDS-PAGE分離膠(0.75 mm);2.31 ml ddH2O,2.8 ml濃度為30%的Acrylamide/Bis(29:1)(Bio-Rad),1.75 ml的1.5M Tris-CL,pH 8.8(Sigma-Aldrich Ltd.),70 μl濃度為10%的SDS(Bio-Rad),70 μl 10 %APS(Bio-Rad),2.8μl TEMED(Bio-Rad)

?5%SDS-PAGE濃縮膠(0.75 mm); 1.7 ml ddH 2 O,0.415 ml 濃度為30%的Acrylamide/Bis(29:1)(Bio-Rad),0.315 ml的1M Tris-CL,pH值為6.8(Sigma),25 μl濃度為10%的SDS(Bio-Rad),25 μl濃度為10 %的APS(Bio-Rad),2.5 μl的TEMED(Bio-Rad)

?10X Tris-Glycine緩沖液(Sigma)

?V-GES灌膠模具(Wealtec)

?V-GES電極與電泳槽(Wealtec)

?制冷恒溫金屬浴(Wealtec)

?恒溫金屬浴(Wealtec)

?膠鏟(Wealtec)

?考馬斯藍(lán)染色緩沖液(濃度為0.1%的考馬斯亮藍(lán) R-250(Bio-Rad)溶于水/甲醇/乙酸(比例: 45:45:10)混合液中)

?脫色緩沖液(水/甲醇/乙酸(比例:45:45:10))

?配有紫外/白光轉(zhuǎn)換板的Dolphin Doc凝膠成像系統(tǒng)(Wealtec)



步驟

灌膠并將膠塊置入電極中:

?灌膠之前,用75%的乙醇擦試玻璃板和膠條。向上抬起翼型扳手打開灌膠模具,并將模塊水平放置到臺(tái)面。將玻璃板和膠條按順序放入V-GES灌膠模具中(圖 2)。

?記得將校正卡恰當(dāng)?shù)夭迦牒癫AО迮cU形玻璃板之間的空隙,以確保膠條插入位置準(zhǔn)確。合攏灌膠模具后并直立放置,雙手均勻用力向下扣住翼型扳手以關(guān)閉灌膠模具。若位置正確,校準(zhǔn)卡應(yīng)該可以正常上下抽拉活動(dòng)而不被夾在膠條與玻璃板之間。(圖3- 5)

?用5 ml分離膠溶液(圖 6)制備濃度為12%的SDS-PAGE凝膠,然后用移液管將1 ml乙醇滴入裝好的灌膠模具中。等候60分鐘使凝膠聚合。當(dāng)把溶液倒入玻璃板夾層之間時(shí),將移液管嘴直接置于玻璃板之間,緩慢地滴出液體,盡量避免形成氣泡。凝膠完成聚合后,移除乙醇,將制備好的濃縮膠溶液倒入到分離膠上。輕輕將0.75 mm 10孔梳子插入玻璃板之間。確保無氣泡產(chǎn)生(圖 7)。讓濃縮膠聚合60分鐘。

?在900 ml蒸餾水中稀釋100 ml 10 X緩沖液,并添加SDS, 制成zui后濃度為3.5mM的 SDS-PAGE電泳緩沖液。

?將兩個(gè)翼型扳手均勻施力掰開,從灌膠模具中取出凝膠三明治夾。通過灌膠模具背后留的兩個(gè)大孔,輕輕向上將三明治夾推出(圖 8)。

?將電極放入垂直電泳槽內(nèi)。貼著電極壁,將凝膠三明治夾垂直方向插入電極中(圖 9)。

?把凝膠三明治夾置于合適的位置后,關(guān)閉電極門(圖10)。

?如只運(yùn)行一塊凝膠,則需要把膠門(很厚的玻璃板)插入到電極空著的一邊。將SDS-PAGE電泳緩沖液倒入凝膠三明治夾與膠門之間,直到緩沖液表面距離玻璃板上緣1cm(圖 11)。檢查是否有滲漏。將1升的SDS-PAGE電泳緩沖液倒入槽內(nèi)凝膠組件的周圍。


樣品制備和裝載:

?將試管插入至制冷恒溫金屬浴(4℃),以解凍冷凍牛血清白蛋白(BSA)(1 mg/ml)樣品。 然后,加入25μl 4X蛋白染料及75 μl的已解凍牛血清白蛋白溶液。

?把樣品加樣到凝膠中前, 請(qǐng)?jiān)诤銣亟饘僭≈幸?5℃的溫度煮沸混合好的 BSA樣品、預(yù)染標(biāo)記和 ProMarker,5分鐘。

?向凝膠中裝載樣品前,用100μl的移液器輕輕抽放緩沖液沖洗井孔讓樣品孔更平滑。在把樣品放入凝膠前,做簡(jiǎn)單離心與混勻保證蛋白溶液濃度不變。在每個(gè)孔中注入10μl的蛋白質(zhì)樣品(圖 12)。

?將安全蓋安裝到槽頂部,并將電極導(dǎo)線連接至電源(圖 13)。

?開始電泳:90 V運(yùn)行60分鐘,130V再運(yùn)行60分鐘。

?電泳后,將膠鏟插入到兩玻璃板之間,輕輕來回撬動(dòng)直到兩板分開,把凝膠從玻璃板上移除(圖 14)。 除去上層膠,用考馬斯亮藍(lán)溶液染色下層分離膠15分鐘。

?將凝膠置于脫色緩沖液過夜震蕩進(jìn)行脫色。

?通過Dolphin-Doc凝膠成像分析系統(tǒng)的紫外/白光轉(zhuǎn)換板拍照。



結(jié)果

圖1. 電泳后的凝膠。左邊外側(cè)孔裝載預(yù)染色marker,右邊兩個(gè)外側(cè)泳道裝載Pro-marker。中間的孔裝載1 mg/ml的牛血清白蛋白 (BSA)。濃縮膠部分已被除去。


備注

?在12%的分離膠中用恒定電壓輸出設(shè)置對(duì)樣品進(jìn)行分離, BSA(66.2 kDa)被地分離到相對(duì)于預(yù)染色Marker(Bio-Rad)在凝膠中的遷移的位置。

?在制作下層分離膠的同時(shí),將溶液注入玻璃板后, 請(qǐng)使用EtOH溶液或蒸餾水將凝膠處理平整。否則,外道的蛋白質(zhì)會(huì)傾向于向一側(cè)偏斜。

?分離小體積、或者大小體積的蛋白質(zhì)/多肽時(shí),可能需要使用不同凝膠濃度、分離時(shí)間和電壓設(shè)置。除了向蛋白質(zhì)樣品添加諸如熒光蛋白染色劑等添加劑外,混合物也可能改變蛋白質(zhì)的遷移特性。

?實(shí)驗(yàn)者在組裝玻璃板和膠條的過程中務(wù)必格外小心。若膠條放置不當(dāng),可能導(dǎo)致漏膠。使用校準(zhǔn)卡可以更方便地找到膠條的正確位置。

?組裝好灌膠模具之后,可在倒入制膠溶液之前, 用移液管往玻璃板夾層注水, 并等待約5分鐘,以測(cè)試是否有滲漏。

上海根生生物科技有限公司
地址:上海市奉賢區(qū)南橋鎮(zhèn)南橋路377號(hào)1幢
郵箱:genshengtech@163.com
傳真:86-021-64190979
關(guān)注我們
歡迎您關(guān)注我們的微信公眾號(hào)了解更多信息:
歡迎您關(guān)注我們的微信公眾號(hào)
了解更多信息